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自上个世纪90年代至今，美国、日本和欧盟等国以现代分子生物学的研究成果为基础，研究开发了生物检测法（Bioassay，以下简称为BioA）[1]。这种方法一出现，则一军突起，给很多检测领域带来了革命性变化，似乎要形成了未来检测技术的新发展趋势。德国把BioA列为今后重要发展领域说明了这一点。另一方面，世界各国面对自去年开始在全球范围内实施的以控制和削减持久性有机污染物（POPS）为主要内容的斯德哥尔摩公约（简称为POPS 公约），为了控制和削减POPS 而对二恶英类（dioxins，DXN）、残留农药和环境荷尔蒙等进行测定的BioA法应运而生，并显示了其快速、灵敏、特异性强、操作简便，不需要昂贵仪器设备，成本低的优点，受到各国的极大关注。例如，日本环境省业已确定了要积极推动BioA法的开发和研究，并逐步实现BioA 法向国家标准监测方法（以下简称为国标法）过渡的方针。由于利用BioA 法测定DXN与目前各国采用的高分辨GC/MS（以下简称为HR•GC/HR•MS）相比，其成本可以降低60%-80%，分析所需要的时间由10-20天缩短到2-3天，操作简便，因而通常人们称它为简易测定法，目前这一技术受到发达国家和发展中国家的普遍重视。本文以废物焚烧炉的烟气、飞灰和炉灰中DXN测定为例扼要介绍DXN简易测定法，为我国实施POPS 公约和环境污染监测创造条件。
一、国外DXN简易测定法的进展
为了说明近几年来国外DXN简易测定法的研究和实用情况，在表1中列举了国外采用DXN简易测定法的进展情况。
二、生物检测法的几种类型及其原理
（一）BioA法的分类
目前，简易测定法包括色谱/低分辨质谱（GC/LRMS）和BioA两种方法。本文重点介绍BioA法。所谓BioA法是指利用当某种特定物质如DXN与小型生物，细胞或者生物组成物质反应时的特异性响应或应答来测定某种特定物质的活性或量的方法。因而它是一种分子水平的快速，超微量检测技术。近几年来，BioA法已在农业、食品、医疗、环境等领域得到广泛应用。其中，目前国内外用来测定DXN的几种方法的分类（见图1）及其原理分述如下。
（二）几种BioA法的原理
1.通讯基因检测法的原理
经过多年来的研究，研究人员基本弄清了DXN在生物体内产生毒性的机理。当DXN与细胞接触时，DXN首先与细胞内的Ah受体相结合，然后转移到细胞核内。Ah受体与DXN结合之后
表1 国外关于DXN简易测定法（BioA）的沿革年表
图1 BioA法的分类
与ARN[Aryl hydrocarbon Reportor Nuclear Translocator(Protein):Ah受体核易位蛋白质]结合之后又与DNA链上的特定部位，即XRE（Xenobiotic Response Element:异物应答排列元件）或DRE（Dioxin Response Element:二恶英应答排列元件）结合并诱导出细胞色素P450酶（Cytochrome P 450 Enzyme，一种药物代谢酶），从而显现毒性。通讯基因检测法就是基于如上所述的DXN在生物体内寻找和诱导基因的机理建立起来的DXN定量检测方法（见图2）。
在这里使用的重组细胞中引入了寻找和诱导出如同萤火虫等生物的发光酶，即荧光素酶（luciferase）的通讯基因，因而通过测定在通讯基因作用下生成的荧光素酶的活性就可以对DXN量进行定量。在这里，采用了引入能够寻找和识别荧光素酶的通讯基因的重组细胞，如101L细胞[（来自人肝癌细胞（Hep G2））或Hepa-1L1.6细胞（来自大白鼠肝癌细胞）]，而通讯基因则使用了萤火虫荧光素酶通讯基因。
2.利用抗Ah受体复合体抗体的免疫检测法原理
当DXN在生物体内显现出毒性时，与Ah受体相结合的DXN，Ah受体和ARNT三者便形成一个复合体。抗Ah受体复合体抗体的免疫检测法的基本原理是把上述形成复合体的Ah受体、ARN和DRE当做主要反应物（试剂），利用对上述复合体产生特异性反应的抗体的抗原抗体反应，并根据与样品DXN量相对应的标记酶的显色反应程度对DXN进行定量在这里Ah受体取自土拔鼠（marmof）的细胞溶质（Cytosol）；ARNT采用杆菌病毒（baculovirus）并通过昆虫培养细胞生产出来的，是一种来自人的Ah受体核转移蛋白质。DRE则采用人工化学合成的。其中，一次抗体则使用能够识别Ah受体复合体中的抗ARNT部分的抗ARNT多克隆抗体。
3．Ah受体/PCR检测法的原理
1983年由美国Kar B.Mullis和加拿大Michael Smith创立了一种叫做聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，又称特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，解决了体外无限扩
增核酸片段的问题。因此，穆利斯和史密斯二人获得了1993年诺贝尔化学奖。由于PCR技术在短时间内将极微量的靶DNA快速准确地扩增上百万倍，因而大大提高了DNA分析和检测[2]。
当DXN和Ah受体结合时，Ah受体一旦与ARNT结合后使其活性得到很大提高（活化）并与具有特定DNA排序的DRE相结合。Ah受体/PCR检测法则利用这种DXN、Ah受体、ARNT和DRE四者的相互结合特性，可以通过PCR技术实时测定出与Ah受体相结合的DRE探针的量（含有DRE的DNA片段），因而对DXN进行定量测定（见图4）。目前普遍使用的实时荧光PCR（real-time fluorescent PCR）技术和荧光PCR扩增仪同时具有PCR扩增和荧光检测功能，而且加入样品之后的操作全部靠荧光PCR仪器自动完成。
图4 Ah受体PCR检测法原理示意图
图5 利用抗DXN抗体的免疫检测法原理示意图
(图2至 图5引自日本环境省DXN对策室太田志津子论文)
4．利用抗DXN抗体的免疫测定法（ELISA）原理[3]
该法的原理是利用对DXN具有特异性反应的抗原体反应，通过样品中DXN与标记物物质的反应对DXN量进行定量的一种方法(见图5)。目前应用得比较多的方法主要有利用标记物质并通过酶的酶免疫吸附检测法（Enzym Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）和利用荧光标记的荧光免疫检测法（fluorescent labeled immunoassay）两种。
三、BioA与国标法的比较
目前，BioA已进入了实用化阶段，很多厂家早已开始出售商品化的试剂盒或自动化测定设备，并以此减少由于人为操作造成的沾污和人为污染，因而操作起来比较简便。虽然在不同方法之间其测定结果有所不同，但对每一种方法来说，测定精密度高，可以适用于废物焚烧炉的烟气、飞灰和炉渣中DXN测定。在这里以DXN检测的几个主要环节为例对BioA与目前国内外使用的国标法（HRGC/HRMS）作比较并说明BioA的特点。
（一）样品的前处理
在焚烧三物质中的DXN检测中，无论是HRGC/HRMS法还是BioA，前处理是至关重要的。由于到目前为止，我国尚未制定焚烧三物质的国家标准测定方法或部级标准方法，只有行业标准方法，即HJ/T77-2001，所以在这里以国外的国标法如美国EPA和日本JIS的方法作为国标法作比较。
BioA与国标法在从样品的采集、保存和样品制备到提取、浓缩、提取物的纯化为止的操作过程基本相同。但在BioA中一般经过盐酸处理，索氏抽提，二氯甲烷提取之后，即可“进样”，从而简化了国标法中反复多次对色谱柱进行净化的繁杂步骤，而且也不需要添加放射性同位素13C12标记的17种内标化合物。
（二）仪器测定步骤
经上述步骤制备出来的样品，在国标法中要用价格昂贵的HRGC/HRMS联用仪上进行超微量分析。但在BioA中则按照试剂盒或仪器说明书中指定的操作方法进行操作，而且不再需要加入
其他任何试剂，所以被人们称之为“无试剂操作”。换言之，在这个无试剂操作中不需要HRGC/HRMS联用仪，替代它的只是吸收光度计，荧光光度计或荧光PCR扩增仪等小型检测设备，而且分析需要的时间由国标法10-20天缩短到1-3天。这就是人们对BioA所期待的成本低，分析所需要的时间短，操作简便，快速获得测定结果的优点。
（三）标准曲线（工作曲线）
在BioA和国标法一样，用四氯代二苯并二口恶英（2，3，7，8-TeCDD）作为标准绘制标准曲线（工作曲线）。不过，在国标法是直接测定样品中每一种DXN异构体的量并以此求得其等效毒性当量数（TEQ：Toxic Equivalent Quantity）。但是BioA表示的是总DXN的等效毒性总和，叫做等效毒性当量数的相应值，但不能直接反映每一种异构体的含量，因而也不能反映出每一种异构体的TEQ，所以，BioA法的检测值（TEQ）与国标法的TEQ之间始终保持着很好的相关性是十分重要的。另一方面，由于每一种BioA的原理，测定系统不同而标准曲线的线形范围和绘制标准曲线的公式有所不同，因而一般采用试剂盒或仪器公约提供的公式或自己的经验公式来绘制标准曲线。（四）检出下限，定量下限
从理论上讲在上面介绍的几种BioA技术的检测灵敏度很高。例如，上述方法C，即PCR技术可以将极其微量的靶DNA按百万倍以上的数量级扩增到足够检测的DNA数量，而且能从100万个细胞中检测出一个靶细胞或将pg量级的靶DNA扩增到μg水平。另据资料表明，在上述方法D，即酶免疫检测法（EIA：Enzyme Immunoassay）中，酶的检出限可以达到（0.002-1）×
10-18mol/100min，甚至可以检测到一个酶分子。但是在实际工作中，由于将生物材料的活性或反应转换成光电信号以后的仪器检测系统中，其检出下限（DL：Detection Limit）和定量下限（QL：Quantification Limit）下降了很多。例如，上述方法A中通常把超过溶剂空白值的3倍的DXN标准物质的最低浓度（0.15pg/well）和超过溶剂空白值的10倍的最低浓度0.25pg/well分别作为检出下限和定量下限。另外，对焚烧三物质检测来说，把排放标准值（换算成TEQ浓度）的1/10以下作为定量下限就可以满足实际检测的要求。由于篇幅有限，更详细的操作步骤见文后参考文献。
四、采用BioA法时需要注意的几个问题
BioA法从本质上说，本来在生物体体内发生的某些反应或生物材料的活性搬到体外并在人工条件下再现出来的过程，因而来自待测样品，前处理，检测仪器以及人为操作等必然造成沾污或干扰。这就使BioA法的检出下限，精密度和重现性等比理论值有所下降。因此，在采用BioA法时必须要考虑到BioA法的适用范围和目的，而且同时要注意如下几个问题。
（一）与现行的国标法之间的关系
目前各国都把HRGC/HRMS作为国标法，而BioA法刚刚步入实用阶段，尚未上升到国标法，而且其检测下限，定量下限和重现性等方面还有一定的局限性，因而目前作为国标法的一种补充方法，可以在指定的领域，如大面积的污染源和污染范围的调查，污染水平的筛选监测，废物焚
烧三物质以及环境污染紧急事件调查等方面适用。而且在现阶段处理因DXN造成的污染纠纷或涉及到罚款或处罚等情况下，不应采用BioA法，必须要用国标法。
（二）假阳性和假阴性问题
在PCR技术中，极微量的污染都有可能导致假阳性。例如操作过程中的污染，如反应试管或微量移液管中的沾污，由操作人员造成的沾污等。在免疫学技术中，如样品中多环芳烃（PAH），酚类等交叉反应性高的化合物未清除干净时，也会出现假阳性。另外，在PCR技术中有时因为Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制等原因而出现假阴性。
（三）操作人员要掌握基础知识和操作技术
BioA法属于前沿技术，是一种超微量分析。不能因为简易检测法而认为什么人都能作，这是一个误解。因此从事BioA操作人员不仅要掌握方法的原理和操作技巧，而且始终保持清洁的实验室环境、严格地按规定程序进行操作，才能获得准确、可靠的检测结果。
五、结语
现在，环境安全，农产品和食品安全已经成为全球性大问题。这种形势又催生了各种现代生物检测技术，而且其发展日新月异。本文介绍的内容就是其中的一小部分。近几年我国在农产品，食品和医药品开发等领域先后开展了ELISA，PCR，生物芯片等技术的研究开发，而且取得了明显的成绩[4]。值得一提的是，我国在DXN监测技术方面与国外的差距很大，如果在发展思路上不作调整，则很难改变这种局面。我们期望尽早研究并推广现代生物检测技术，早日解决大家十分关注，但大家“心中无数”的DXN问题。
主要参考文献
[1] Behnisch.P.A， Hosoe.K and Sakai.S: Bioanalytical Screening methods for dioxins and dioxin-link compounds-a
review of bioassay/biomarker technology，Environment International，27.413-439(2001).
[2] 陈福生、高志贤、王建华主编：食品安全检测技术与现代生物技术，北京：化学工业出版社，2004。
